INOKULASI DAN ISOLASI | asalshareinfo

INOKULASI DAN ISOLASI

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian dan kesterilan yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu : 

 Menyiapkan ruangan ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan di labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast) dimana udara dilewatkan dalam saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986). 

 Pemindahan dengan pipet. Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986). 

 Pemindahan dengan kawat inokulasi Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel, ujungnya boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang diameternya 1-3 mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya berupa tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986). Berikut gambar alat yang diperlukan dalam isolasi dan inokulasi: 

Gambar 19. Media dalam cawan petri 

Gambar 20. Jarum ose 

Gambar 21. Encast 

Gambar 22. Inkubator 

Sumber gbr.www.google.com/imgressa 

Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium dalam cawan petri, dapat digunakan metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar). Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer pada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan bakteri. 

Gambar 23. A. Teknik gores dengan agar miring;   b.  Teknik tusuk 

Sumber : gbr.www.google.com/imgressa 

a. Beberapa Metode Inokulasi pada Cawan Petri

Terdapat beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Termasuk dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode cawan tuang. Berdasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu, melalui anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati  (Afrianto, 2004). Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciriciri kultural morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies  (Dwidjoseputro, 2005).  

Menurut Hadioetomo (1993), terdapat dua metode yang dilakukan untuk memperoleh biakan murni yaitu : 

1) Metode cawan gores Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.

  

Gambar 24. Metode Cawan Gores 

Sumber gbr.www.google.com/imgressa 

Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni. Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. 

Cara ini dilakukan dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada sumber isolat , kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen. Setelah kering, ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. 

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni (Winarni, 1997). 

Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan oleh para siswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna, 1990).

Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masingmasing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kus Irianto, 2006). 

Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni: 

a.  Teknik Gores T 

Gambar 25. Teknik Gores T 

Sumber Gambar, www,google.com/imgrassa 

b.  Teknik Gores Sinambung (gambar)   

Gambar 26. Teknik Gores Sinambung 

Sumber Gambar. www.google.com/imgressa 

c. Teknik Gores Kuadran 

Gambar 27. Gores Kuadran 

Sumber gbr.www.google.com/imgressa 

c. Metode cawan tuang 

Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan 125pecimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan ( ±50 oC ) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba dalam 125pecimen pada umunya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurangkurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan dan waktu, namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi. 

Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian menuangkannya pada cawan petri atau dengan menyemprotkan suspensi pada dasar cawan petri, kemudian menuang medium agar dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya masing-masing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal.

Gambar 28. Metode Cawan Tuang

Sumber gbr.www.google.com/imgressa 

Selain kedua metode tersebut masih ada satu metode inokulasi dalam cawan petri yaitu metode sebar atau spread plate. Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal. Teknik spread plate (cawan sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau menghapuskannya di atas media agar yang telah memadat, sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan agar. Salah satu contoh metode cawan sebar adalah metode swab atau hapus. 

Gambar 29. Metode Swab  

Sumber gbr.www.google.com/imgressa 

d. Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow. Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006).

Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni yang tetap pada tempatnya  (Nur; Asnani, 2007).

Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari berbagai spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber bakteri harus diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200 bakteri yang ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni yang berasal dari bakteri tunggal. 

Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.  Ada beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu dengan cara goresan (streak plate), cara tuang (pour plate), cara sebar (spread plate) dan mikromanipulator (Buckle,1998).

Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbernya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000). 

Metode pemaparan pada udara terbuka adalah metode untuk mengisolasi bakteri udara. Metode ini sangat simpel, yaitu dengan memaparkan medium pada udara terbuka, dengan harapan ada bakteri yang menempel dan kemudian akan tumbuh menjadi koloni. 

Tugas : 

Carilah informasi tentang jenis- jenis, proses inokulasi dan isolasi mikroba melalui pengamatan gambar, bagan, bahan asli atau dari berbagai sumber lainnya misalnya internet atau buku yang relevan. Tanyakan kepada guru apabila ada hal yang belum jelas, kemudian buatlah ringkasan dan presentasikan di depan teman/kelompok lain

e. Pengertian dan Tujuan Pengenceran 

Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan bakteri yang ditanam (Fais, 2009). Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan sehingga volume larutan menjadi berubah (Nurohaianah et al, 2007). 

Teknik Dilusi (Pengenceran) Tujuan dari teknik ini adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam aquades steril. Teknik dilusi sangat penting dalam analisa mikrobiologi karena hampir semua metode penelitian dan perhitungan jumlah sel mikroba menggunakan teknik ini, seperti TPC (Total Plate Count). 

f. Pengamatan Terhadap Hasil Inokulasi dan Isolasi 

Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan setelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan, sehingga pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan (Ratna,1990).  

Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang menyebar terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida, 2000).

Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agaragar lempengan, pada agar-agar miring dan pada tusukan gelatin adalah sebagai berikut: 

 Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat berbenang, tak teratur, serupa akar, serum kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting. 

 Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang, serupa duri, serupa tasbih, serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar. 

 Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat 

mengencerkan gelatin. Karena itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda. Adapula bentuk koloni yang tidak dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat dari samping koloni yang tidak mengencerkan gelatin dapat serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan gelatin, maka bentuk koloninya dapat serupa kawah, serupa mangkuk, serupa corong, pundi-pundi dan berlapis. 

Gambar 30. Ciri- ciri koloni 

Sumber gambar,www,google.com/ imgreesa 

Berikut gambar koloni hasil inokulasi 

Gambar  28.b.koloni hasil isolasi 

Sumber gambar,www,google.com/ imgreesa 

Inkubasi merupakan suatu  teknik perlakuan bagi mikroorganisme yang telah diinokulasikan pada media (padat atau cair) kemudian disimpan pada suhu tertentu untuk dapat melihat pertumbuhannya. Bila suhu inkubasi tidak sesuai dengan yang diperlukan, biasanya mikroorganisme tidak dapat tumbuh dengan baik. Media inkubasi digolongkan menjadi 2 jenis : 

1. Pada lemari biasa atau suhu kamar, 

2. Pada inkubator yang suhunya dapat di tentukan 

Proses ini bertujuan agar dapat melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan pada mikroorganisme.

Destruksi merupakan proses pemusnahan pada hasil pekerjaan mikrobiologi yang telah mengandung mikroorganisme sebelum dilakukan pencucian. Proses destruksi ini penting untuk dilakukan, hal ini bertujuan untuk membersihkan semua mikroorganisme yang terdapat pada alat-alat yang telah digunakan pada saat percobaan karena tidak dapat dipastikan bahwa alat-alat itu bersih sebelum didestruksi, bisa saja terdapat bakteri atau mikroorganisme yang dapat membahayakan. Proses ini umumnya dilakukan dengan memasukkan semua wadah atau alat hasil percobaan (yang sudah dikontakan dengan mikroorganisme) ke dalam autoclave, kemudian diaktifkan pada suhu 121 derajat celcius selama 30 menit. Bila telah selesai, wadah yang mengandung media dan mikroba hasil percobaan (yang telah cair) dapat di buang ke pembuangan umum, kemudian alat dicuci bersih dengan air sabun.